東海大学医学部基礎医学系分子生命科学 School of Medicine, Tokai University
Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (PITT) 法
1980年にGordonらによって受精卵への顕微注入法によるトランスジェニックマウス作製法が開発されましたが、この方法の欠点はトランスジーンが複数コピーでゲノムに挿入されることが多く、その挿入位置もコントロールできないことであると言えます。その結果、導入遺伝子の発現にばらつきが生じたり、他の遺伝子を潰している恐れもあるため、複数系統のトランスジェニックマウスを樹立して調べる必要性がありました。これを回避する手法としては、ES細胞内での相同組換えを利用した遺伝子ターゲティング法がありますが、顕微注入法と比較してトランスジェニックマウス系統が確立されるまでに多くの時間、コスト、労力を要することとなります。
RMCE法。PITT法では受精卵でこれを行う。
そこで私たちは、マウス受精卵への顕微注入法にCre-loxP部位特異的組換え系を応用することにより、狙った遺伝子座位へ目的遺伝子を導入するトランスジェニックマウス作製法、”Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (PITT法)”を開発しました（Ohtsuka et al. 2010）。 PITT法は、Cre-loxPシステムに基づいたRecombinase-mediated cassette exchange (RMCE) 法をin vivoに応用したものです。これまでにPITT法を用いて多数のトランスジェニックマウス系統を樹立していますが、ほぼ全て期待通りで再現性のある導入遺伝子発現パターンを示していました。例えば、図の各種蛍光遺伝子トランスジェニックマウスは、全てが全身で安定した蛍光遺伝子の強発現を示していることが明らかとなっており、各種移植実験などに用いられています。これらの一部は理研BRCから入手可能です。
開発当初の2010年の段階では、その導入効率は4-5%でした。ファウンダーマウスの90%以上で次世代への導入遺伝子の伝搬が確認されています。また、本手法を用いて再現性のあるノックダウンマウス作製も可能であることも示しました。従って、従来のトランスジェニックマウス作製法と同様の労力で実行可能であるPITTシステムは、導入遺伝子発現の再現性の高さからも次世代型のトランスジェニックマウス作製法として期待されるものでした（Ohtsuka et al. 2012）。
improved PITT (i-PITT) 法
PITT法により期待通りの遺伝子発現を示すトランスジェニックマウスが再現性良く得ら れることが分かりましたが、トランスジーンの挿入効率の低さや、マウスの遺伝的背景が統一されていないなど、改善すべき点も残されていました。そこで私たちは、これらの改善に取り組んできました。遺伝子挿入効率については、それまでプラスミドDNA（Cre発現プラスミド）として注入していたCreをmRNAとして注入することで、約20%程度にまで上げることに成功しました（Ohtsuka et al. 2013）。
マウスの遺伝的背景については、C57BL/6N系統の種マウス（変異loxP配列等のタグを既知のゲノム配列[Rosa26座位]中に有しているマウス）を新たに作製することによって解決しました。この新規種マウス（TOKMO-3マウスと命名）には、変異loxP配列の他に、PhiC31インテグラーゼ認識配列であるattP配列や、FLP-FRT部位特異的組換え系に用いられる変異FRT配列も同時に付加されています。これにより、複数の組換え系から好きなものを選んで使用できるようになりました。また、複数の組換え系を同時に使用することで（例えば、Cre mRNAとPhiC31 mRNAを混合して注入するなど）、組換え効率（遺伝子挿入効率）が更に向上することを見出し（平均20〜30%程度）、これをimproved PITT (i-PITT) 法と名付けました。さらに目的遺伝子を有するドナーベクターを複数種類混合して注入することで、複数のトランスジェニックマウス系統を１回の顕微注入実験で得られることも分かりました（Ohtsuka et al. 2015）。