CRISPR/Cas9用RNAの精製 　　　　　　　　　　　　

 

 

[試薬・機器]

• 合成したRNA（on ice）

• MEGA clear kit ＆ MEGA Shortscriptの2 x LD Buffer

• RNA用チューブ(0.2ml/1.5ml)およびチップ類(大/中/小)

• 100％ EtOH

• 70％ EtOH

• 2 mlチューブ(コレクションチューブ、他のキットから流用)

• 廃液用ビン

※MEGA Clear kitの新品のwash solutionには、最初に20 mlの100％ EtOHを加え、チェックを入れておく

 

[手順]

1. サンプル数 x 100 µl のElution Solutionを1.5mlチューブにとり、70℃で予熱しておく

2. サンプル数分のカラムとコレクションチューブを用意する

3. RNAを新しい1.5 mlチューブに全量移し、Elution Solution(室温)を100 µlになるように加える(RNA 21 µl + Elution Solution 79 µl)

4. Binding Solutionを350 µl 加える

5. EtOHを250 µl加え、穏やかにピペッティングしてカラムに全量入れる

6. 14000 rpm at RTで1min遠心

7. ろ液を捨て、Wash Buffer 500 µlを加えて14000rpm at RT で1min遠心

8. ろ液を捨て、Wash Buffer 500 µlを加えて14000rpm at RT で1min遠心

9. ろ液を捨て、空のまま1min遠心

10. Collection チューブにカラムを移し、予熱しておいたElution solutionを50 µl加えて1min静置

11. 14000rpm at RT 1min遠心

12. さらに、予熱しておいたElution solutionを50 µl加えて1min静置

13. 14000rpm at RT 1min遠心

14. 回収したRNA溶出液(100 µl)に10分の1量の5M酢酸アンモニウムを加え(10 µl)、さらに2.5倍量のEtOH(275 µl)を加えて、ボルテックス

15. -20で30min以上冷やす

16. 14000rpm at 4℃で25min遠心

17. チップでEtOHを除去し、70％ EtOH 300 µlを加えて10min遠心

18. チップで上清を除去

19. 70℃のヒートブロックで2minペレットを乾燥

20. 15 µl (要検討)のRNase Free Waterに溶解

21. 0.5 µlをを別のチューブに移し、4.5 µlのRNase Free Water を加える(10倍希釈)。残りの14.5 µlのRNAは-20℃で一時保存

22. 10倍希釈RNAを濃度測定した後(残り4 µl )、等量の2 x LD buffer(4 µl)を加えて、98℃で3minインキュベート

23. 変性したRNAを、泳動チェック

 

※GONAD法に使用するCas9 mRNAは、できる限り高濃度に(4 µg/µl以上)したいので、少量のRNase Free Waterに溶解

　その後、1.5 mlチューブに1.0 µlずつCas9 mRNAを分注(極めて正確に)