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　sgRNA調製　　　　　　　　　　　　

 

1. sgRNA合成用テンプレートDNAの作製 (PCR産物をテンプレートとする場合)

 

[試薬・機器]

  • KOD Fx Neo [ToYoBo]

  • 切り出し用ゲル(low melが望ましい)

  • フェノール

  • エタノール沈澱用試薬

  • RNase Free Water

 

[手順]

  1. KOD Fx NeoのPCR条件にしたがって、 (pUC57-sgRNA expression vector)をTemplate DNAとしPCR反応

  2. 少量のPCR産物を泳動してチェックしたのち、抽出用のゲルで泳動

  3. ゲルからDNAを抽出し、フェノール精製とエタ沈後、RNase Free Waterに溶解

  4. 濃度測定と泳動チェックを行い、-20℃で保存

 

※別のkitで精製できればそれでも可。ただし純度と泳動チェックは必ず実施する

 

 

2. sgRNAの合成

 

[試薬・機器]

  • MEGA shortscript T7 Kit

  • RNA用0.2ml PCRチューブ

  • RNA用チップ類(大・中・小)

  • 氷

  • Template DNA (PCR産物[上記]または直鎖状プラスミド)

  • サーマルサイクラー

 

 

[手順]

  1. サーマルサイクラーを37℃ Pauseにセット

  2. T7 10X Reaction Buffer, T7 ATP/CTP/UTP/GTP Solution, Nucrease-free Waterをそれぞれ室温で溶解した後、ボルッテクス・スピンダウンして氷上に置く。また、T7 Enzyme Mixも氷上においておく

  3. 0.2mlチューブを用意して、試薬を混合(T7 Enzyme は最後に加える)

 

Nuclease-free Water                                X µl

T7 10X Reaction buffer                          2.0 µl

ATP・CTP・GTP・UTP Solution      各2.0 µl (total 8.0 µl)

Template DNA                                          Y µl

T7 Enzyme Mix                                      2.0 µl

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Total                                                     20.0 µl (X+Y=8.0 µl)

 

4. 穏やかにピペッティングしたのち、サーマルサイクラーにセットして反応

      ※4hr – 5hr反応させる

5. Turbo DNaseIを1.0 µl加えて、さらに15min 反応(Template量が多い際は30min)

6. -80℃で保存、または精製に進む(必要なら、ここで一度RNAを泳動してチェックする)

 

 

 

その後、合成したRNAの精製に進む

 

 

 

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