sgRNA調製　　　　　　　　　　　　

 

1. sgRNA合成用テンプレートDNAの作製 (PCR産物をテンプレートとする場合)

 

[試薬・機器]

• KOD Fx Neo [ToYoBo]

• 切り出し用ゲル(low melが望ましい)

• フェノール

• エタノール沈澱用試薬

• RNase Free Water

 

[手順]

1. KOD Fx NeoのPCR条件にしたがって、 (pUC57-sgRNA expression vector)をTemplate DNAとしPCR反応

2. 少量のPCR産物を泳動してチェックしたのち、抽出用のゲルで泳動

3. ゲルからDNAを抽出し、フェノール精製とエタ沈後、RNase Free Waterに溶解

4. 濃度測定と泳動チェックを行い、-20℃で保存

 

※別のkitで精製できればそれでも可。ただし純度と泳動チェックは必ず実施する

 

 

2. sgRNAの合成

 

[試薬・機器]

• MEGA shortscript T7 Kit

• RNA用0.2ml PCRチューブ

• RNA用チップ類(大・中・小)

• 氷

• Template DNA (PCR産物[上記]または直鎖状プラスミド)

• サーマルサイクラー

 

 

[手順]

1. サーマルサイクラーを37℃ Pauseにセット

2. T7 10X Reaction Buffer, T7 ATP/CTP/UTP/GTP Solution, Nucrease-free Waterをそれぞれ室温で溶解した後、ボルッテクス・スピンダウンして氷上に置く。また、T7 Enzyme Mixも氷上においておく

3. 0.2mlチューブを用意して、試薬を混合(T7 Enzyme は最後に加える)

 

Nuclease-free Water                                X µl

T7 10X Reaction buffer                          2.0 µl

ATP・CTP・GTP・UTP Solution      各2.0 µl (total 8.0 µl)

Template DNA                                          Y µl

T7 Enzyme Mix                                      2.0 µl

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Total                                                     20.0 µl (X+Y=8.0 µl)

 

4. 穏やかにピペッティングしたのち、サーマルサイクラーにセットして反応

      ※4hr – 5hr反応させる

5. Turbo DNaseIを1.0 µl加えて、さらに15min 反応(Template量が多い際は30min)

6. -80℃で保存、または精製に進む(必要なら、ここで一度RNAを泳動してチェックする)

 

 

 

その後、合成したRNAの精製に進む