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　Cas9 mRNA調製　　　　　　　　　　　　

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1. RNaseA処理（このステップはスキップ可能です）

​

[試薬・機器]

  • pBGK plasmid (1 µg/µl程度)

  • RNaseA : final 10µg/ml [キアゲン]

  • 13% PEG/1.6M NaCl

  • フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(PCI) 25:24:1 [ナカライ]

  • エタノール沈澱用試薬

  • 10mM Tris/0.1mM EDTA (10T0.1E)

 

[a]

Plasmid 30µl

RNaseA(100µg/µl) 10µl →100mg/mlのキアゲンのものを10T0.1Eで1000倍希釈して使用(100µg/ml)

D.W 60µl

--------------------------------

Total 100µl

 

[手順]

  1. 上記[a]のようにplasmidサンプルとRNaseA 溶液を混合し37℃, 20min反応

  2. 100µlの13% PEG/1.6M NaClを加えて、氷上で1hr静置

  3. 12000rpm, 5min at 4℃で遠心、上清をデカントで除去

  4. 70%EtOH でリンス、遠心して上清除去

  5. すぐにペレットを200µlの10T0.1Eに溶解

  6. PCIを200µl加え、フェノクロ処理

  7. 70%EtOHでリンス

  8. 20µlの10T0.1Eに溶解

 

 

2. XbaI処理

 

[試薬・機器]

  • 10X Buffer2 [NEB]

  • 100X BSA [NEB]

  • XbaI [NEB]

  • 1%アガロースゲル in TAE buffer

  • PCI

  • クロロホルム

  • エタノール沈澱用試薬

  • RNase Free Water [Ambion]

 

[b]

sample             20µl

10X Buffer2     12µl

100X BSA       1.2µl

XbaI                6.0µl

D.W                 81µl

----------------------------

Total               120µl

 

[手順]

  1. 上記[b]の条件でサンプルと制限酵素試薬を混合、37℃で3hr~5hrほど反応

  2. XbaI処理後、サンプルを0.5µl程度泳動して切断チェック

  3. XbaI処理したサンプルに、D.W 285µlと3M NaOAc 40µlを加える

  4. PCIを450µl加えてvortexして、遠心

  5. 遠心後、上清を1.5mlチューブに回収して、クロロホルムを450µl加えvortexして、遠心

  6. 遠心後、上清を新しいチューブに回収して、 870µlのEtOHを加え、穏やかに混合 (この時点で、DNAの糸が確認できる)

  7. 再度遠心(12000rpm 10min at RT)して、上清を除去したら70%EtOHでリンス

  8. 風乾後、 20µl程度のRNase Free Waterに溶解

  9. 濃度測定と、泳動チェックをしたら、-20℃で保存

 

 

3. Cas9 mRNAの合成

 

[試薬・機器]

  • mMESSAGE mMACHINE T7 Uitra kit [ambion, AM1345]

  • RNA用0.2ml PCRチューブ

  • RNA用チップ類(大・中・小)

  • 氷

  • Template DNA (直鎖状プラスミド：上記)

  • サーマルサイクラー

 

[手順]

  1. Nuclease-free waterは融解後室温で保持。T7 2X NTP/ARCAは融解後 on iceで維持

  2. サーマルサイクラーを予め37℃ Pauseにセット

 

[c]

Nuclease-free Water         X µl

T7 2X NTP/ARCA         10.0 µl

10X T7 Reaction buffer   2.0 µl

Template DNA                   Y µl

T7 Enzyme Mix               2.0 µl

---------------------------------------------------------

Toatl                                 20 µl (X+Y=6.0µl)

 

3. 上記(c)の条件(上から順番に加える)で0.2ml PCRチューブに試薬を混合(室温)

4. 穏やかにピペッティングしたのち、37℃(サーマルサイクラー)で5hr反応

5. 反応後、1.0 µlのTURBO DNaseを加え、37℃で15min-30min 反応

6. 反応終了後は、-80℃で保存

 

※反応後、RNA精製(MEGA clear kit)に進む場合は、氷上へ

※心配なときは、この時点で一度泳動チェックしてもよい

 

 

その後、合成したRNAの精製に進む

 

 

 

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